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siyaku blog

ー 研究の最前線、テクニカルレポート、
実験のコツなどを幅広く紹介します。 ー

【連載】ScreenFect™通信 「Vol.4 HeLa 細胞への plasmid DNA 導入データ」 

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ScreenFect™A plus を用いた HeLa 細胞への plasmid DNA 導入実績及びリバーストランスフェクションプロトコールをご紹介します。

ScreenFect™A plus のクイックプロトコールは、当社データベースからダウンロードできます。

HeLa 細胞へのリバーストランスフェクションプロトコール例 (24ウェルプレート)

細胞の前培養
1. 適当な培養容器 (T-75 フラスコなど)を用いて、HeLa 細胞をセミコンフルエントになるまで培養する。

トランスフェクション試薬の調製
1. 滅菌処理した 1.5mL 容チューブを 2 本用意する。
2. 上記工程で用意した 1 本のチューブに ScreenFect™ Dilution buffer を 22 μL 添加する。
3. 2に 3 μL の ScreenFect™A plus Reagent を添加して全量で 25 μL にする。・・・溶液(A)
(ScreenFect™A plus Reagent は使用前にボルテックスして下さい。)
4. 1で用意したもう 1 本のチューブに ScreenFect™ Dilution buffer を 24 μL 添加する。
5. 4に 1 μL のプラスミド溶液を添加する。・・・溶液(B)
(プラスミド溶液の濃度は 1 μg/μL とする。濃度が薄い場合、添加量が増えるので Dilution Buffer の量を調節して下さい。)
6. 溶液(A)のチューブに溶液(B)全量を添加する。
7. 混合したチューブをタッピングで良く混合し、卓上遠心機でスピンダウンする。
8. 室温で 5 〜 20 分間インキュベーションする。

細胞懸濁液の調製
1. 〈細胞の前培養〉で用意したフラスコをインキュベーターから取り出す。
2. 培地を捨て、PBS で1回洗浄する。
3. トリプシン溶液を 2 mL 添加し、室温または、37℃の CO2 インキュベーターでインキュベーションし、細胞を培養容器から剥離させる。
4. FBS 添加培地を約 5 mL 添加し反応を止める。
5. ピペッティングでよく細胞を分散させ、遠沈管に全量移す。
6. 150 × g, 5 分間遠心する。
7. ペレットを捨てないよう上清を除く。
8. 新しい培地を 5 〜 10 mL 添加し、ピペッティングで細胞を分散する。
9. 血球計算盤などの細胞カウンターを用いて細胞数を測定する。
10. 測定した結果から計算して、2.0 × 105 cells/mL の細胞懸濁液を調製する(調製する細胞懸濁液量は実験スケールに応じて適宜調節する)。

トランスフェクション
1. 〈細胞懸濁液の調製〉で調液した細胞懸濁液 500 μL をウェルへ添加する。
2. 〈トランスフェクション試薬の調製〉の 8 でインキュベーションしておいた DNA-lipid complex 50 μL をウェルに添加し、プレートを軽く揺すって混合させる(ウェルに予め DNA-lipid complex 50 μL を添加しておき、そこに細胞懸濁液を 500 μL 添加しても構わない)。
3. CO2 インキュベータで 24 〜 48 時間培養し、実験に供する。

実験データ

HeLa 細胞へリバーストランスフェクション法で GFP 融合遺伝子の導入実験を行い、蛍光顕微鏡にて導入遺伝子の発現効率を比較しました。その結果、ScreenFect™A plus が最も高いGFP陽性細胞率を示しました。

〈HeLa細胞における性能比較〉(リバーストランスフェクション(1-STEP))

jiho_86-1_SFA_01.png

上記以外の ScreenFect™ シリーズの詳細情報は専用 HP をご覧ください。

さまざまな細胞に対するトランスフェクションプロトコール例をご紹介予定です。
掲載をご希望される細胞がございましたら、こちらのメールアドレスまでご連絡下さい。→ jiho@wako-chem.co.jp
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