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siyaku blog

ー 研究の最前線、テクニカルレポート、
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【連載】ScreenFect™通信 「Vol.1 ヒトiPS細胞への遺伝子導入データ」 

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 ScreenFect™A plus を用いたヒト iPS 細胞への遺伝子導入実績及びプロトコールを紹介します。iPS 細胞の足場として使用される Matrigel のプレートコーティング方法、Y-27632 を含む細胞懸濁液の調製プロトコール、また最適化された試薬比率を記載しますので、ご参考下さい。

ヒトiPS細胞(201B7株)へのトランスフェクションプロトコール例

ここでは、StemSure® hPSC 培地Δ(コード No. 197-17571)を使用したプロトコール例を一部紹介します。本プロトコール完全版や mTeSR1 培地を使用したプロトコールは、当社データベースをご参照下さい。

トランスフェクション試薬の調製

2.0μL の ScreenFect™A plus reagent、4.0μg のプラスミド DNAが 160μL の Opti-MEM に含まれるように DNA-lipid complex を作製する。

Matrigel によるプレートコーティング

1.Matrigel hESC-Qualified Matrix を 4℃で溶解する。室温で溶解すると凝固するため避ける。
2.Matrigel 300μL を冷却した D-MEM/Ham's F-12 25mL で希釈する。
3.希釈した Matrigel 溶液を 12 ウェルプレートに 1mL/well 加える。
4.室温で1時間以上インキュベートする。

細胞懸濁液の調製

1.StemSure® hPSC 培地Δを 2 〜 8℃で数時間から一晩かけてゆっくり融解する。37℃では解凍しない。一週間以内に使用する。
2.融解後の StemSure® hPSC 培地Δに bFGF(コード No. 064-05381, 068-05384)を終濃度 35 〜 100ng/mL で添加し、完全培地を調製する(以下、sshPSC 培地という)。
3.sshPSC 培地は使用前に室温に戻す。温浴は使用しない。
4.Y-27632 を sshPSC 培地へ終濃度 10μmol/L となるように添加する(以下、ROCKi+ 培地という)。
5.hiPS 細胞を培養中のプレートより、培地を除去し、細胞をPBS(-)で一度洗浄する。
  *細胞は 80% 程度のコンフルエントとなった対数増殖期の状態でトランスフェクションして下さい。
6.PBS(-)を除去し、StemPro Accutase を添加する。
7.37℃、5% CO2 インキュベーターで 5 分間静置する。
8.ROCKi+ 培地を添加し、P1000 マイクロピペットを用いて、コロニーを剥がし、シングルセルへ分散する。
9.15mL チューブに移す。
10.1,000rpm(約 170 × g)で 3 分間、室温で遠心する。
11.上清を除去する。 ROCKi+ 培地で再懸濁する。
12.生細胞数を計測する。
13.ROCKi+ 培地で 5 × 105 cells/mL に細胞濃度を調製する。

トランスフェクション

用意しておいた DNA-lipid complex に調製した細胞懸濁液を 1mL 添加し、ピペッティングでよく混合して、全量を 12 ウェルプレートに播種する。
※ポイント
播種から 24 時間経過時に培地交換を行って下さい。このときの培地は Y-27632 を含む必要はありません。

実験データ

hiPS細胞(201B 7株)へリバーストランスフェクション(1-STEP)でGFP融合遺伝子の導入を行い、蛍光顕微鏡にて導入遺伝子の導入効率を比較しました。

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使用上の注意

・ヒトiPS細胞への遺伝子導入は、シングルセルの状態で行うことをおすすめします。
・遺伝子導入時の細胞数は約5×105 cells/wellをおすすめします。
・プラスミドDNA量が多いとき、導入遺伝子の発現量が高いことにより細胞死が引き起こされることがあります。

Matrigel は、Corning Incorporated の商標または登録商標です。
mTeSR は、WARF の商標または登録商標です。
Opti-MEM、StemPro は、Life Technologies Corporation の商標または登録商標です。

今後、順次各細胞に対するトランスフェクションプロトコール例をご紹介予定です。
掲載をご希望される細胞がございましたら、こちらのメールアドレスまでご連絡下さい。→ jiho@wako-chem.co.jp
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