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医薬品安全性試験

毒性試験について

医薬品・化粧品の安全性を確認する動物実験のため、多くの動物が犠牲となっていました。一方、動物愛護の立場からは、生命科学研究に用いる試験法をなるべく動物を使用しない方法「動物実験代替法」に変更する事が求められてきています。その方法は、培養細胞に対する毒性や細胞増殖能を調べるもので、細胞が薬剤なのど検体により壊された時に壊された時に漏れ出る酵素量を測定したり、生細胞が色素を取り組むことを利用したものです。動物実験代替法は、実験動物を用いた方法に比べ安価で手間がかからず、客観的に毒性を測定する事が可能です。

参考:第十七改正日本薬局方

T細胞依存性抗体産⽣(TDAR)機能試験⽤ ELISA キット

レビス® KLH(TDAR)ラット-IgG/-IgM

本キットはラット⾎清・⾎漿中の抗KLH(Keyhole limpet hemocyanin)IgG/IgM 測定⽤ ELISA キットです。医薬品の免疫毒性試験に関するガイドラインICH S8 で推奨されているT 細胞依存性抗体産⽣試験(TDAR:T cell Dependent AntibodyResponse)にご使用ください。

KLH 投与後の特異的IgG/IgM を測定し、TDAR 機能を⾼感度・微量検体・短時間で再現性良く試験できます。

特長

  • 短時間(全反応時間:2時間20分)で測定可能
  • 微量な試料で測定可能
  • 環境に優しい防腐剤を使⽤
  • 全ての試薬が溶液タイプですぐに使⽤可能
  • ⾼い再現性

キット構成

KLH 固相化 96 ウェルプレート
96 ウェル/枚
ラット抗 KLH-IgG(-IgM)標準溶液
200 μL/本
緩衝液
100 mL/本
HRP 結合抗ラット IgG(IgM)抗体
100 μL/本
発色液(TMB)
12 mL/本
反応停⽌液(1M H2SO4
12 mL/本
濃縮洗浄液(10 x)
100 mL/本
プレートカバー
1枚
取扱説明書
1部
検量線範囲

IgG ⽤ 0.47 ~ 30 ng/mL
IgM ⽤ 3.13 ~ 200 ng/mL

検体

ラット⾎清、⾎漿

KLH 投与スケジュール(例)

動物:CD(SD)ラット(4匹)、8w、♀
KLH:Cat No. 374813(Calbiochem)⽣理⾷塩⽔に溶解し1mg/mL とした

  • dokusei-1.png

製品一覧

富士フイルムワコーシバヤギ株式会社製品

コードNo.メーカーコード品名容量希望納入価格(円)
632-13751 AKRKG-010 レビス® KLH(TDAR)ラット-IgG ELISA KIT 96回用 60,000
639-13761 AKRKM-010 レビス® KLH(TDAR)ラット-IgM ELISA KIT 96回用 60,000
637-30781 AKMOKG-014 レビス® KLH(TDAR)サル-IgG ELISA KIT 96回用 見積り
634-30791 AKMOKM-014 レビス® KLH(TDAR)サル-IgM ELISA KIT 96回用 見積り

ラット尿中微量アルブミン測定⽤試薬(⾃動分析機専⽤)

レビス® 尿中アルブミン-ラット(Sタイプ)

本キットは尿中腎障害マーカーとして利⽤される尿中アルブミンを測定することができます。

特長

  • ⾃動分析装置で短時間(10分)測定が可能
  • ラットアルブミンに特異的に反応
  • 無調製試液なので取扱いが簡便
  • 測定範囲が広く、再現性に優れている
  • 乳ビ、溶⾎の影響をほとんど受けない
  • ⾎清中アルブミンの定量測定も可能

キット構成

反応試薬1(緩衝液)
18.5 mL/本
反応試薬2(抗ラットアルブミン抗体試液)
6.6 mL/本
標準尿中ラットアルブミン溶液
2.0 mL/本
標準尿中ラットアルブミン希釈溶液
4.0 mL/本
取扱説明書/パラメーター表(日立7070, 7170, 7080, 7180)
1部
検量線範囲

マウス・ラット 6.17 ~ 500μg/mL
サル      2.5 ~ 202μg/mL
(ロットにより前後します)

検体

ラット尿、⾎清、⾎漿

交差性
動物種平均標準偏差
CD(SD) 19.4 0.13

6週齢、♀、5匹、単位:μg/mL

ラット尿検体アルブミン測定結果
動物種項目交差性
Mouse Albumin 55%未満
Human Albumin 30%以下
Porcine Albumin 25%以下
Bovine Albumin 18%以下
  • 10% FCS 検出感度以下
    交差性は、500μg/mL 時の測定結果(FCSは除く)
操作法(⽇⽴⾃動分析装置7180の場合)

dokusei-02.png・尿(そのまま⼜は適当に希釈して⽤います)※
・⾎清(101倍希釈して⽤います)
※検体を事前に希釈する場合は⽣理⾷塩⽔で希釈する

製品一覧

富士フイルムワコーシバヤギ株式会社製品

コードNo.メーカーコード品名容量希望納入価格(円)
634-25301 AKRAL-020S レビス® 尿中アルブミン - ラット(Sタイプ) 60回用 54,000
630-25303 AKRAL-020SZ1 レビス® 尿中アルブミン - ラット(SZタイプ) 250回用 145,000
638-25561 AKRAL-021S レビス® 尿中アルブミン - マウス(Sタイプ) 60回用 54,000
634-25563 AKRAL-021SZ1 レビス® 尿中アルブミン - マウス(SZタイプ) 250回用 145,000
635-25831 AKRAL-022S レビス® 尿中アルブミン - サル(Sタイプ) 60回用 56,000

ラット尿中微量アルブミンELISAキット

レビス® アルブミン-ラット

キット構成

抗体固相化96 ウェルプレート
96ウェル/ 枚
アルブミン標準溶液(ラット)(10μg/mL)
150μL/ 本
緩衝液
60mL/ 本
ペルオキシダーゼ標識抗体
100μL/ 本
発⾊液(TMB)
12mL/ 本
反応停⽌液(1M H2SO4
12mL/ 本
濃縮洗浄液(10 x)
100mL/ 本
プレートシール
3 枚
取扱説明書
1 部
測定範囲

50 〜 1,000ng/mL(標準曲線範囲)

検体

ラット尿、⾎清、⾎漿

交差性
動物種項目交差性
Mouse Albumin 5%未満
Human Albumin 検出感度以下
Porcine Albumin 検出感度以下
Bovine Albumin 検出感度以下

10% FCS検出感度以下
交差性は、10,000ng/mL 時の測定結果(FCSは除く)

製品一覧

株式会社シバヤギ製品

コードNo.メーカーコード品名容量希望納入価格(円)
631-04311 AKRAL-120 レビス® Kアルブミン - ラット 96回用 55,000
631-31921 AKRAL-220 レビス® アルブミン - ラット(2プレートタイプ) 96回用 x 2 90,000
634-04301 AKMOKG-014 レビス® アルブミン - マウス 96回用 55,000
638-31931 AKRAL-221 レビス® アルブミン - マウス(2プレートタイプ) 96回用 x 2 90,000

細胞毒性試験キット(FACLS法)

細胞毒性フルオロテストワコー

本キットはFluorometric Assay based on Cell Lysis & Staining method(FACLS法)を⽤いた、死細胞、全細胞数および細胞⽣存率を測定するキットです。
測定には核酸蛍光染⾊剤と細胞溶解剤とを組合せて使⽤します。この核酸蛍光染⾊剤は、細胞膜に障害を受けた死細胞の膜を通過して核酸と反応することにより蛍光を発し、⽣細胞に対しては膜透過性を⽰しません。

特長

  • 付着細胞・浮遊細胞ともに使⽤可能
  • 同⼀ウェル内で死細胞数、全細胞数および細胞⽣存率が測定可能
  • 培地交換・細胞洗浄・細胞遠⼼分離等の煩雑な操作不要
  • 酵素反応を利⽤しないため、薬剤によるpHの変動・測定温度・反応時間・⾎清⼊りの培養液に含まれる酵素活性等の⼼配なし
  • ラジオアイソトープ、有機溶媒等を使⽤しないため操作や廃棄が容易
  • 死細胞を選択的に検出でき、吸光測定法に⽐べ⾼感度測定が可能
  • 2ステップで操作が完了。蛍光プレートリーダーを⽤いて多検体処理が可能
  • 測定波⻑:励起420nm、蛍光460nm
測定原理

1) 測定系にFluorescence Reagentを添加し、その蛍光強度(FD)から測定系内の死細胞を定量する。
2) 同⼀の測定系にさらにLysis溶液を添加し、⽣細胞膜に障害を与えた後、蛍光強度(Fr)を測定して存 在する全細胞を定量する。
3) FDとFrの差を算出し、全細胞数蛍光強度(Fr)で割ることにより細胞⽣存率を算出。

  • dokusei-03.png

製品一覧

コードNo.品名規格容量希望納入価格(円)
293-55001 細胞毒性フルオロテストワコー 細胞毒性測定用 1,000回用 150,000

細胞毒性試験キット(LDH Assay)

LDH-細胞毒性テストワコー

本製品は、培養細胞を⽤いて各種薬剤の毒性を簡便に測定するためのキットです。
各種薬剤により細胞膜に障害を受けた死細胞から遊離したLDH(乳酸脱⽔素酵素)を直接測定するため、⾼感度測定が可能です。

特長

  • 付着細胞・浮遊細胞ともに使⽤可能
  • 酵素測定法のため、細胞毒性を定量的に精度よく測定可能
  • 検体処理時間や発⾊反応時間を変えることにより感度調節が可能
  • 吸光マイクロプレートリーダーを⽤いて多数の検体を測定可能
  • 測定波⻑:吸光560nm

キット構成

発⾊試薬ニトロブルーテトラゾリウム、ジアホラーゼ、NAD(3.7mg/vial)
5mL ⽤ x 10本
緩衝液DL- 乳酸リチウム(50mg/mL)
55mL x 11本
反応停⽌液 塩酸(1mol/L)
55mL x 11本
96 ⽳マイクロプレート
10枚(未滅菌)
測定原理

LDHの作⽤により乳酸がピルビン酸に酸化されると同時に、補酵素NADはNADHに還元される。サンプル中のLDH活性に⽐例して⽣成されるNADHは、ジアホラーゼの酵素作⽤でニトロブルーテトラゾリウムを還元して、⻘紫⾊のジホルマザンを⽣成する。この呈⾊液の560nm(±10nm)の吸光度を測定する。

  • dokusei-04.png

製品一覧

コードNo.品名規格容量希望納入価格(円)
299-50601 LDH-細胞毒性テストワコー960 細胞毒性測定用 960回用 28,800

Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST

Cytotoxicity LDH Assay Kit-WSTは、細胞が障害を受けたとき培地中に放出される乳酸脱⽔素酵素(LDH)活性を指標に細胞毒性を測定するキットです。

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特長

細胞存在下(ホモジニアスアッセイ)・細胞培養液のみ(ノンホモジニアスアッセイ)どちらでも測定可能

dokusei-07.pngCytotoxicity LDH Assay Kit-WSTは細胞培養液に直接試薬を添加するホモジニアスアッセイと、細胞培養液の上清を使うノンホモジニアスアッセイのいずれの⽅法でも測定が可能です。そのため実験状況に応じた測定⽅法をお選びいただけます。

調製した溶液は⻑期間保存可能(冷蔵、6ヵ月)

LDH Assayに使⽤するWorking solutionは、調液後6ヵ⽉間、冷蔵にて保存が可能 です。調製後の溶液が安定なため、試薬の無駄を省くことができます。dokusei-06.png

  • ⼤容量の2,000回⽤はお得な38,000 円(19円/1ウェル)。毒性試験で⼤量に使⽤する場合のコストを低減
細胞毒性試験の評価について

⽣細胞の呼吸活性(ATPやNADPH)を指標にした細胞毒性試験を⾏う場合、常に①⽣細胞が減少しているのか、②細胞⾃体の呼吸活性が落ちているのかという2 つの可能性を考えなければいけません。このとき、⽣細胞の呼吸活性だけではなくLDH Assayでも細胞毒性試験を⾏うことで、毒性試験のデータの裏付けを取ることが出来ます。

  • dokusei-09.png

右図のデータは、HeLa細胞におけるMitomycin Cの細胞毒性をCell Counting Kit-8とCytotoxicityLDH Assay Kit-WSTを併⽤して測定した結果です。グラフからMitomycin Cの添加により⽣細胞が減少し、死細胞が増加したことが分かります。
この2つのアッセイによって確かに「⽣細胞が減少した」という信頼できるデータが得られました。

ポイント:細胞毒性試験は2つの指標で評価することが重要

製品一覧

株式会社同仁化学研究所製品

コードNo.メーカーコード品名容量希望納入価格(円)
347-91751 CK12 Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST 100回用 9,600
343-91753 CK12 Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST 500回用 25,400
341-91754 CK12 Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST 2,000回用 38,000

⽣細胞数測定キット

Cell Counting Kit-8

Cell Counting Kit-8は細胞増殖および細胞毒性を⽐⾊法で⾼感度に測定するキットです。発⾊試薬に⽔溶性のホルマザンを⽣成する⾊素(WST-8)使⽤しており、溶解操作が不要です。さらにWSTは細胞毒性が低いため、細胞増殖 / 毒性の評価後、その細胞を他の試験に使⽤することも可能です。本キットは⼀液タイプで操作性も良く、冷蔵での⻑期保存が可能です。

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特長

発⾊⾊素の溶解操作が不要
Cell Counting Kit-8は新規テトラゾリウム塩「WST-8」を採⽤。テトラゾリウム塩、ホルマザン(⾊素)ともに⾼⽔溶性のため、MTTアッセイのような溶解操作が不要です。
1ボトル溶液タイプで試薬の調製が不要
本キットは必要な試薬を含む1ボトル溶液タイプのため、Working solutionなどの試薬調製が不要。時間の節約にも貢献します。
  • キットは冷蔵保存で⼀年間安定dokusei-12.png
  • 低細胞毒性で試験結果への影響を低減dokusei-13.png

ポイント三次元培養での細胞毒性評

Cell Counting Kit-8は⽇産化学⼯業(株)のFCeM®®シリーズを使⽤した三次元培養での細胞毒性評価が可能です。

プロトコル
  • HeLa細胞をFCeM®培地で5⽇間培養し、スフェロイドを形成させる
  • スフェロイドをFCeM®培地で希釈し、1.0 x 105cells/mLの細胞懸濁液を調製する
  • 96ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液を50μLずつ播種する
  • 各濃度のMitomycinC(終濃度:1~24 x 10 − 6mmol/L)を含む培地50μLを添加する
  • 48時間CO2インキュベーターで培養する
  • Cell Counting Kit-8溶液10μLを添加する
  • CO2インキュベーターで2時間呈⾊反応を⾏い、450nmの吸光度を測定する
  • dokusei-14.png

製品一覧

株式会社同仁化学研究所製品

コードNo.メーカーコード品名容量希望納入価格(円)
341-07761 CK04 Cell Counting Kit-8 100回用 5,200
347-07621 CK04 Cell Counting Kit-8 500回用 13,200
343-07623 CK04 Cell Counting Kit-8 2,500回用 36,600
341-08001 CK04 Cell Counting Kit-8 10,000回用 101,000
  • ・掲載内容は、2018年1月時点での情報です。
  • ・表示している希望納入価格は「本体価格のみ」で消費税等は含まれておりません。
  • ・表示している希望納入価格は本記事掲載時点の価格です。

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